銅と銀のナノ粒子の相乗的な抗菌効果とその作用機序

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9202 (2023) この記事を引用

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細菌感染症は、世界中で主な死因の 1 つです。創傷感染症などの局所的な細菌感染症の場合、銀 (Ag) は歴史的に最も広く使用されている抗菌剤の 1 つです。しかし、科学出版物は、人間の細胞に対する銀の悪影響、生態毒性、および細菌感染を完全に排除するには抗菌効果が不十分であることを実証しています。ナノ粒子 (NP、1 ～ 100 nm) の形で Ag を使用すると、抗菌性 Ag イオンの放出を制御できますが、感染を排除して細胞毒性を回避するにはまだ十分ではありません。この研究では、Ag NP の抗菌特性を強化する、さまざまに官能化された酸化銅 (CuO) NP の効力をテストしました。 CuO NP (CuO、CuO-NH2 および CuO-COOH NP) と Ag NP (未コーティングおよびコーティングあり) の混合物の抗菌効果を研究しました。 CuO と Ag NP の組み合わせは、Cu または Ag (NP) 単独よりも、グラム陰性大腸菌や緑膿菌などの抗生物質耐性株、グラム陽性黄色ブドウ球菌、エンテロコッカスフェカリス、 Streptococcus dysgalactiae。我々は、正に帯電したCuO NPがAg NPの抗菌効果を最大6倍強化することを示しました。特に、CuO NP と Ag NP の相乗効果と比較して、それぞれの金属イオンの相乗効果は低く、抗菌効果の向上には NP 表面が必要であることが示唆されました。我々はまた、相乗効果のメカニズムを研究し、Cu+ イオンの生成、Ag NP からの Ag+ のより速い溶解、および Cu2+ の存在下でのインキュベーション培地のタンパク質による Ag+ の結合の低下が相乗効果の主なメカニズムであることを示しました。要約すると、CuO と Ag NP の組み合わせにより、抗菌効果を最大 6 倍高めることができました。したがって、Cu はヒト細胞にとって不可欠な微量元素であるため、CuO と Ag NP の組み合わせを使用すると、Ag と相乗効果による優れた抗菌効果を維持し、有益な効果を高めることができます。したがって、Ag の抗菌効果を高め、安全性を向上させ、局所的な細菌感染を予防および治療するために、創傷ケア製品などの抗菌材料に Ag と CuO NP を組み合わせて使用することをお勧めします。

新しい抗菌薬の開発は、世界保健機関と科学界が掲げる最優先事項の 1 つです1。最近のメタ分析では、2019 年に抗生物質耐性に関連して 495 万人が死亡したことが示され、抗生物質耐性細菌感染症に対処するための緊急措置の必要性が強調されました 2。創傷感染症は慢性感染症の一種であり、四肢の切断などの重篤な結果を引き起こし、管理しなければ死に至る可能性があります。症例の 15 ～ 27% では、細菌による創傷感染が四肢の切断を必要とする壊疽につながります 3。このことは、現在の創傷感染管理戦略が非効率的であり、改善されたアプローチが必要であることを示しています。

従来の抗生物質の分野では、現在、細菌感染症を治療し耐性を回避するための最も有望なアプローチの 1 つとして、組み合わせ相乗概念が考えられています4。さまざまな薬剤を組み合わせることで薬剤の投与量を減らすことができるため、単独療法に比べて副作用が少なくなります5。

しかし、抗生物質は全身投与され、その組み合わせにより予測不可能な薬物動態プロファイルが生じます。局所的に適用される NP の組み合わせは、全身性抗生物質のこれらの欠点を回避します。したがって、相乗的 NP の適用は非常に有望であると考えられます。私たちは、細菌に対する作用機序が異なるため、Cu と Ag NP は一緒に適用するとより高い抗菌効果を発揮するのに対し、Cu はこれまで知られている中で最高の金属ベースの抗菌剤である Ag NP の抗菌効果を高めるのではないかと仮説を立てています。さらに、Cu は微量元素であり、創傷治癒に有益であり、線維芽細胞の移動を刺激し、コラーゲン合成を促進し、血管新生に不可欠であり、創傷治癒 6 と骨再生 7 をサポートします。したがって、Cu と Ag NP の組み合わせは優れた抗菌効果を持ち、創傷治癒を改善するため、感染した創傷に対して非常に有益な治療法となる可能性があります。

これとは別に、CuO NP と Ag NP の両方の抗菌効果がよく研究されています。「銀ナノ粒子* 細菌*」または「銅ナノ粒子* 細菌*」というキーワードを使用して、2023 年 3 月 23 日に実行された PubMed® での検索では、それぞれ 6,558 件と 1,113 件の回答が得られました。

Ag NP 自体の抗菌メカニズムは比較的よく理解されています。細菌と接触すると、Ag NP は細菌の細胞壁に局在して酸化し、NP と細胞の界面で濃縮された Ag が放出されます 8。我々は以前、Ag NPによるグラム陰性細菌の細胞壁への損傷は主に細胞膜で起こるのに対し、細菌細胞の外膜はNPの標的ではないことを示した9。

CuO NP の分子機構はあまり研究されていません。 2008 年に、Heinlaan ら。らは、CuO NP の細菌 Vibrio fischeri に対する毒性 (EC50 = 79 mg/l) だけでなく、甲殻類に対する毒性も、可溶化された Cu イオンによるものであることを示しました 10。特に、その優れた抗菌効果にもかかわらず、CuO のヒト細胞に対する毒性は、Ag および Ag NP の毒性と比較して低いです。 Cu は重要な微量元素であるため、場合によっては CuO NP が血管新生や創傷治癒の改善などのプラスの効果を促進します6。 CuO NP の詳細な抗菌機構は、組換え大腸菌を使用してさらに研究されました11。非生物的条件下では活性酸素種 (ROS) を引き起こさなかった Ag NP とは対照的に、CuO NP、特に正に帯電したものは、有意なレベルの ROS を誘発しました。 NP の表面電荷は、表面官能化によって簡単に変更でき、細菌の不活化に役割を果たします。細菌の細胞壁は負に帯電しているため、正に帯電した NP は細菌の細胞壁によく接着し、細菌をより効率的に不活化する可能性があります。

私たちは、NP の毒性メカニズムを理解し、その有効性と安全性を高めることを目的として、2008 年以来抗菌 NP を研究してきました 1,8,9,10,12,13,14。最近の論文と私たちの研究では、金属ベースの NP またはそれぞれの金属を組み合わせて使用すると、NP の抗菌効果が大幅に強化されることが実証されました。しかし、これまでに出版されたほぼすべての研究は、NP ではなく金属イオンの複合効果に焦点を当てています 15、16、17、18。研究された金属のさまざまな組み合わせ（AgとCu、Zn、Co、Cd、Ni）の中で、AgとCuの組み合わせは、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方に対して最も高い相乗抗菌効果を示しました19。ここ数年でさらに多くの論文が発表され、Cu と Ag の相乗効果への関心が高まっています。そのほとんどは、Cu/Ag20、21 または他の金属、例えばタングステン 22 を添加した Cu/Ag のナノ合金の抗菌特性について説明しています。さらに、チャンとアル。は、感染した創傷マウスモデルにおいて、Cu/Ag/酸化グラフェン複合体の完璧な抗菌抗バイオフィルムおよび創傷治癒特性を示しました23。注目すべきことに、これらの論文はCuとAgの間の抗菌相乗効果を説明しているにもかかわらず、NPの組み合わせの相乗効果またはそのメカニズムの研究を体系的に研究している出版物を確認できませんでした。

この研究では、CuO NP と Ag NP の相乗的な抗菌メカニズムは、それらの相補的な作用機序によって駆動されているという仮説を立てました。つまり、Ag NP は細菌の細胞壁を損傷し、CuO NP の細菌への侵入を促進し、そこで CuO NP が細胞内分子を破壊します。より具体的には、まず、多剤耐性菌を含むさまざまな細菌に対する、異なる官能基を持つ Ag NP と CuO NP 間の相乗的な抗菌効果について説明しました。次に、NP の抗菌相乗効果のメカニズムを理解するために一連のテストを実施しました。外膜の損傷、ROS の誘導、Cu および Ag イオンの生体利用効率、および Cu イオンの電荷変換を測定しました。

この研究で使用した NP の特性を表 1 に示します。CuO NP (CuO) およびアミノ基で官能化された CuO (CuO-NH2) は正のゼータ電位を持ち、カルボキシル基で官能化された CuO (CuO-COOH) は負のゼータ電位を持ちました。潜在的。試験したすべての Ag NP は、コーティングされた銀ナノ粒子 (cAg) の場合の - 56.6 mV からナノ銀 (nAg) の場合の - 27.7 mV の範囲の強い負のゼータ電位を持っていました。 RPMI 細胞培養培地 (RPMI CCM) では、NP のゼータ電位は - 8.9 mV (CuO-NH2) から - 10.8 mV (CuO) の範囲のすべての NP で負でしたが、これはおそらく血清タンパク質の吸着によるものです。 (いわゆる「タンパク質コロナ」、NP の表面へのタンパク質の付着によって生じる動的カモフラージュ) Ivask et al.24 によって以前に示唆されているように。したがって、その後のすべての実験において、タンパク質の吸着が NP 電荷の影響を少なくとも部分的に覆い隠したと考えられます。 Ag NP 間の溶解度は、Ag2O の場合が最も高く、nAg の場合が最も低かった。

相乗効果は、RPMI 細胞培養試験培地を使用して最初に特徴付けられました。これは、RPMI 細胞培養試験培地には成長因子を含む血清が含まれており、組織感染中に現れる浸出液に似ているためです。 NP の相乗的な抗菌効果の例を図 1 に示します。相乗効果を実証するために、最小殺菌濃度 (MBC、寒天培地上で目に見える細菌の増殖が生じない試験済みの最低濃度) を代用として使用しました。大腸菌を不可逆的に不活化するには40 mg/l Ag NPまたは400 mg/l CuO NPが必要でしたが、組み合わせて使用した場合は5 mg/l Ag NP + 25 mg/l CuO NPのみが必要でした（図1）。

CuSO4 と cAg の抗菌相乗効果。大腸菌 K-12 懸濁液を、RPMI 細胞培地中でさまざまな濃度の Ag NP、CuSO4、またはそれらの組み合わせのいずれかと 24 時間インキュベートしました。インキュベーション後、3μlの細菌-NP混合物を寒天培地にピペットで移し、最小殺菌濃度(MBC、暗所で37℃で24時間インキュベートした後に目に見える細菌の増殖が生じない最低試験濃度)を測定した。 cAg と CuSO4 の濃度が軸に示されています。 CuSO4 と cAg の最小殺菌濃度はそれぞれ 400 mg/L と 40 mg/L でした。

異なる NP 間およびさまざまな細菌株間の相乗効果を定量化して比較するために、MBC 値の合計と比較した NP の組み合わせ (ミックス) の抗菌効率を示す「抗菌相乗効果係数」という用語 K(AbS) を導入しました。個々の NP の値を計算し、次のように計算されます (式 1)。

式 (1) は、最小殺菌濃度 (MBC) からの抗菌相乗係数 (K(AbS) ) の計算を示しています。

同様の相乗効果の計算が、Vaidya らによって金属混合物について以前に報告されています 16。 K(AbS) > 1 は相乗効果を示し、K(AbS) = 1 は相加効果を示し、K(AbS) < 1 は拮抗作用を示します。

図 1 は、cAg NP と CuO NP の混合物の MBC が、各成分の MBC よりも数倍低いことを示しています。 \({\text{K}}\left( {{\text{AbS}}} \right) = 1/\left( {\frac{{50\;{\text{mg}}/ {\text{L}}}}{{400\;{\text{mg}}/{\text{L}}}} + \frac{{2.5\;{\text{mg}}/{\text {L}}}}{{40\;{\text{mg}}/{\text{L}}}}} \right)\) = 1/(1/8 + 1/16) = 5.33。したがって、この例では、混合物の抗菌効果は、成分の個別の抗菌効果の合計よりも 5.33 倍高かった。

25 mg/L の CuSO4 + 5 mg/L の cAg の混合物について計算すると、同じ K(AbS) が得られます。ただし、K(AbS) は、CuSO4/cAg 比の他のバリエーション (たとえば、200 mg/L の CuSO4 + 1.5 mg/L の cAg 混合物) では低くなります。 Cu/Ag 比に応じた K(AbS) の差を補足図 1 に示します。最も高い K(AbS) は、1:1 から 12.5:1 Cu/Ag の比を使用して主に観察されました。

異なる細菌の異なる Cu 成分単独および cAg との混合物の MBC 値を補足表 1 に示します。緑膿菌の cAg MBC が低かったにもかかわらず、Cu 化合物に耐性のある緑膿菌を除いて、異なる細菌の MBC は同様でした。他の細菌と同様です。

さまざまな細菌の計算された K(AbS) を図 2 に示します。ほとんどの Cu 化合物と Ag NP の間の明らかな抗菌相乗効果が見つかりました (図 2、補足表 1)。

RPMI 細胞培養培地中のさまざまな細菌の cAg 成分と銅成分間の抗菌相乗係数。平均値と標準偏差が表示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001。 cAg、コーティングされた銀ナノ粒子。 CuO 酸化銅; CuO–NH2、アミノ基でコーティングされた酸化銅。 CuO-COOH、カルボキシ基でコーティングされた酸化銅。 CuSO4、硫酸銅。

CuO NP の中で、cAg で最も高い K(AbS) が観察されたのは、官能化されていない CuO、特にどちらも正に帯電した CuO-NH2 です。 K(AbS) が最も低いのは負に帯電した CuO-COOH で観察され、ほとんどが 2 未満でした。これは、CuO NP の元の電荷 (MQ 水のゼータ電位に反映される) が抗菌相乗効果に影響を与えたことを示唆しています。興味深いことに、タンパク質コロナにより、NP の電荷は細胞培養培地中で均一でした (表 1)。これは、細胞培養培地中でタンパク質コロナが形成された後でも、NP の一部の元の表面が利用可能なままであることを示唆しています。

最も高い K(AbS) は、E. faecalis と E. coli (K-12 と ESBL の両方) で観察されました。この研究では、大腸菌 ESBL は大腸菌 K12 と比較して抗生物質に対する耐性が高く、cAg に対する耐性も高かったことに注目するのは興味深いことです。ただし、これらの細菌の場合、K(AbS) 値は同様でした。 E. faecalis では、すべての組み合わせで高い K(AbS) が観察されました。これは、腸内細菌 (大腸菌など) と比較して Cu 成分による DNA 破壊速度が速いためと考えられます 25。

緑膿菌は、テストしたすべての細菌の中で最も低い K(AbS) を示しました。その理由は、強力な抗薬物流出システムと外膜透過性の低下である可能性があります26。

私たちは、さまざまな Ag NP と AgNO3 を使用して追加の研究を実施し、そのうちのどれが Cu 成分とのより強い抗菌相乗効果を持つかを決定しました。

補足表 2 は、混合物および単独のさまざまな Ag および Cu 成分を含む大腸菌 K-12 における MBC の結果を示しています。計算された K(AbS) を図 3 に示します。

大腸菌 K-12 株を含む RPMI 細胞培養培地中の異なる Ag 成分と Cu 成分間の抗菌相乗係数 (K(AbS))。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001、##P < 0.01 拮抗。 K(AbS) は、混合物または単独の成分の平均 MBC からではなく、さまざまな実験からの平均 K(AbS) として計算されたことに注意してください。平均値と標準偏差が表示されます。 cAg、コーティングされた銀ナノ粒子。 nAg、ナノ銀; Ag2O、酸化銀。 AgNO3、硝酸銀; CuO、酸化銅; CuO–NH2、アミノ基でコーティングされた酸化銅。 CuO-COOH、カルボキシ基でコーティングされた酸化銅。 CuSO4、硫酸銅。

Cu 成分と混合すると、ほとんどの Ag NP は高い K(AbS) を示しました。対照的に、AgNO3は、Cu成分との強力な抗菌相乗効果を示さなかった（図3、補足表2）。最も高い K(AbS) は、cAg と CuSO4 および nAg と CuSO4/CuO-NH2 の 3 つの混合物で観察されました。 CuSO4 と CuO-NH2 はよく溶解し (表 1)、したがって Cu イオンの供給源であったという事実は、相乗効果には Cu イオンが必要であることを示唆しています。 Ag2O と CuSO4 の混合物では、典型的な K(AbS) の結果が得られませんでした (相乗効果なし)。 cAg および nAg とは対照的に、Ag2O NP はより酸化 (溶解) していました。これらのデータは、強力な抗菌相乗効果を達成するには、非酸化の Ag NP と Cu イオンの両方が必要であることを強く示しています。

次に、培養培地が抗菌相乗効果に影響を与えるかどうかを検討しました。さまざまな培地における cAg、CuSO4、およびそれらの混合物の MBC を補足表 3 に示し、K(AbS) を図 4 に示します。タンパク質と栄養素の含有量が高い細菌増殖培地では、K(AbS) がより高くなりました。 K(AbS)が最も高かったのはLB培地で、最も低かったのはMQでした(図4)。重要なのは、細菌の増殖もLBで最も速かったことです（補足図2）。これは、活動期および分裂期にある細胞では相乗効果がより顕著であることを示唆しています。おそらく、細菌が活発に増殖している状態では、NP と NP から放出される金属イオンは、DNA を破壊したりタンパク質に損傷を与えたりするために細胞内空間にアクセスしやすくなります 27。興味深いことに、従来の抗生物質も、非増殖期では細菌、特に黄色ブドウ球菌を不活性化する効果が低い28。

さまざまな媒体における抗菌相乗効果の係数。異なる増殖培地中のコーティングされた銀ナノ粒子と硫酸銅の混合物における大腸菌 K-12 株に対する抗菌相乗係数。平均値と標準偏差が表示されます。 MQ MilliQ 水、RPMI。

Cu と Ag の間の抗菌相乗効果のメカニズムを理解するために、いくつかの追加のテストが実行されました。抗菌の相乗効果は、Cu と Ag の異なる作用機序の関数であるという仮説が立てられました。細菌の細胞膜に損傷を与えるベータラクタム系抗生物質と細菌のタンパク質合成を阻害するアミノグリコシドの相互作用は、抗生物質の古典的な相乗効果のよく知られた例です。アミノグリコシドとβ-ラクタムの間の相乗効果は、アミノグリコシドの取り込みの増加につながるβ-ラクタム媒介の膜損傷に起因すると考えられています29。

仮説の 1 つは、成分の 1 つ (Cu または Ag NP) が膜に大きなダメージを与え、別の成分が細胞内に侵入しやすくなり、内部構造に損傷を与える可能性があるというものでした。グラム陰性細胞の細菌外膜を破壊するポリミキシン B 30 を、この実験では陽性対照として使用しました。この仮説を検証するために、2 つのグラム陰性菌、大腸菌 K-12 と緑膿菌 PAO1 の外膜の透過性を測定しました。結果は、AgNO3とcAgが両方の細菌の外膜を損傷したことを示しました（図5a、b）。 cAg は AgNO3 と比較して膜を損傷するのに長い時間を要し、緑膿菌の膜は大腸菌と比較して損傷するまでにより多くの時間を要しました。 CuO NP と CuSO4 は、特に緑膿菌では顕著な膜損傷を引き起こしませんでした。このデータは、Ag化合物の場合、細胞を不活化する方法の1つは細菌の外膜を破壊することであるのに対し、Cu化合物は他の細胞構造に作用することを示唆しています（24時間で細胞死を引き起こす高濃度の銅であっても、急速な外膜破壊には至らない）。 AgとCuの混合物の場合、Agによる膜の破壊はCuがこれらの内部セル構造に到達するのを助ける可能性があります。このデータに基づいて、Cu と Ag 化合物を混合することでこの仮説をテストすることにしました。 Cu化合物とcAgを混合した試験も実施した。膜に対するcAgの損傷作用は、CuSO4またはCu-NH2の添加によって影響を受けませんでした（図5c、d）。 cAg に CuO-COOH または CuO を添加したテストも実施されましたが、CuSO4 または Cu-NH2 の添加と同様に、膜に対するさらなる破壊効果は検出されませんでした（図示せず）。また、外膜に急速にダメージを与えるCu成分をポリミキシンBに添加しても、膜に対するポリミキシンBの効果は増強されなかった(データは示さず)。さらに、MBC 検査における大腸菌 K-12 における CuSO4 とポリミキシン B 間の抗菌相乗効果は検出されていません (K(AbS) = 1.054 ± 0.243、データは示されていません)。したがって、銀と銅は細菌の外膜に対して異なる作用をするが、外膜に対するそれらの作用は抗菌相乗効果の主な原因ではないと結論付けました。

AgおよびCu化合物またはそれらの組み合わせによる細菌外膜の損傷。蛍光の増加は、成分単独 (a、b) および cAg との混合物 (c、d) で 30 分間インキュベートした後の大腸菌 (a、c) および緑膿菌 (b、d) の外膜損傷を示しています。。平均値と標準偏差が表示されます。 cAg、コーティングされた銀ナノ粒子。 AgNO3、硝酸銀; CuO、酸化銅; CuO–NH2、アミノ基でコーティングされた酸化銅。 CuO-COOH、カルボキシ基でコーティングされた酸化銅。 CuSO4、硫酸銅; PB、ポリミキシンB。

Cu イオンが Cu+/Cu++ の間で酸化還元サイクルを行う可能性はフェントン様反応として知られており、活性酸素種 (ROS) が生成され、脂質過酸化、タンパク質の酸化、DNA 損傷を引き起こす可能性があります 31。次に、ROS の生成の促進が Cu 成分と Ag 成分の間の相乗効果の理由である可能性があると仮説を立てました。実際、CuO NP13 および Ag NP32 は ROS を誘導することが以前に示されています。また、我々は以前に、CuO-NH2 が未官能化 CuO および CuO-COOH13 と比較してより多くの ROS を誘発することを実証しました。

この研究における ROS 生成は、生物的 (細菌存在下) 条件と非生物的 (細菌なし) 条件の両方で測定されました (図 6)。最高レベルの ROS は、個々の cAg および CuO-NH2 懸濁液で検出されました（図 6a、b）。 cAgは非生物的条件で最も高いROSレベルを誘導しましたが（図6a）、生物的条件ではCuO-NH2が誘導しました（図6b）。 CuSO4 および AgNO3 の場合、ROS は検出されませんでした。

懸濁液中での活性酸素種 (ROS) の生成。非生物的条件 (a、c) および生物的条件 (b、d) における ROS の誘導の測定。 ROS 誘導の測定は、成分単独 (a、b)、または比率 1:4 の cAg 成分と Cu 成分の混合物 (c、d) でインキュベートした後に実行されました。 cAg、コーティングされた銀ナノ粒子。 AgNO3、硝酸銀; CuO、酸化銅; CuO–NH2、アミノ基でコーティングされた酸化銅。 CuSO4、硫酸銅; RFU、相対蛍光単位。

CuSO4 または CuO-NH2 の添加後に cAg がより多くの ROS を生成するという仮説を制御するために、cAg 成分と Cu 成分の混合物（比率 1:4）中の ROS をテストしました。結果は、CuO-NH2またはCuSO4をcAgに添加しても、生物的および非生物的条件の両方でROS産生を増強しないことを示しました（図6c、d）。さらに、拮抗作用が検出されており（例えば、cAg 単独と比較して cAg + Cu 成分混合物の ROS が低い）、ROS が抗菌相乗効果の原因ではないことが示されています。

金属ベースの NP の毒性は主にそのイオンによって引き起こされるため 10,33、細胞内の Cu および Ag イオンを測定することにしました。そのために、細胞内 Cu および Ag34 に応答してルシフェラーゼを生成する生物発光バイオセンサー E. coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux を使用しました。この細菌では、細胞内の Ag および Cu イオンが用量依存的に細菌の発光を誘導します。

バイオセンサー細菌は選択的ではなく、Ag イオンと Cu イオンの両方を検出するため、細胞内の Ag と Cu を個別に測定することはできませんでした。したがって、相対値と誘導相乗効果係数 K(InS) を使用しました。 K(InS)は抗菌相乗係数と同様に計算した。 K(InS) は、混合物中の成分の生物発光 (LC) ピーク濃度と単独の LC ピーク濃度の比の合計の逆数です (式 2)。

式 (2) は、生物発光 (LC) ピーク濃度 (濃度) からの誘導相乗効果係数 (K(InS)) の計算を示しています。

最初に、個々の Ag および Cu 成分を持つ細菌の生物発光が測定されました (図 7a)。その後、Cu 成分を cAg と混合したところ、LC のピークが左に大きくシフトすることがわかりました (図 7b)。しかし、AgNO3 と混合するとシフトは見られませんでした (図 7c)。成分の個別および混合物中のピーク LC 濃度を補足表 4 に示します。

成分に対する反応としてのバイオセンサー細菌の発光。成分単独での 4 時間のインキュベーションに対する反応としての大腸菌 MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux の発光 (LC) (a)。 cAg 単独と比較して、銅成分と cAg の混合物ではピーク LC が左に大きくシフトしています (b)。 AgNO3 単独と比較して、銅成分と AgNO3 の混合物ではピーク LC にシフトはありません (c)。代表的な数値は 3 つの独立した実験からのものです。 cAg、コーティングされた銀ナノ粒子。 AgNO3、硝酸銀; CuO、酸化銅; CuO–NH2、アミノ基でコーティングされた酸化銅。 CuO-COOH、カルボキシ基でコーティングされた酸化銅。 CuSO4、硫酸銅。

Cu および Ag イオンの細胞内濃度に応答した生物発光の高い誘導が、Cu 成分と cAg の混合物中で観察されました（図 7b）。反応の誘導には、混合物中の cAg および Cu 成分の濃度を低くする必要がありました。 Cu 成分と cAg の組み合わせでは、テストしたすべての混合物で高い K(InS) が示されましたが、Cu 成分と AgNO3 の混合物ではそうではありませんでした (図 8)。 cAg成分とCu成分の混合物の場合、K(InS)が著しく1を超えていたという事実は、バイオセンサー細菌がcAg成分とCu成分の混合物中の金属イオンの細胞内濃度を、別々の成分の合計と比較してより高く感知したことを明らかにした。これは、cAgによって引き起こされる膜の損傷と細胞の内部成分へのCuのアクセスの向上に起因するものではありませんでした（図5c、d）。 CuSO4 と組み合わせると、Cu2+ の存在下で cAg がよりよく溶解するため、Ag の細胞内濃度が高くなったと推測できます。また、AgNO3 の溶解度は非常に高く、Cu イオンによって促進することはできません。そのため、Cu 成分と AgNO3 の間の相乗効果は観察されませんでした。

Cu 成分と Ag 成分の混合物における誘導相乗効果の係数。細菌における生物発光の誘導は、成分単独と比較して、cAg 成分と Cu 成分の混合物に反応してより高かった。この増強された反応は、AgNO3 と CuO NP の混合物では検出されていません。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001、##拮抗作用 P < 0.01。 cAg、コーティングされた銀ナノ粒子。 AgNO3、硝酸銀; CuO、酸化銅; CuO–NH2、アミノ基でコーティングされた酸化銅。 CuO-COOH、カルボキシ基でコーティングされた酸化銅。 CuSO4、硫酸銅。

次に、CuSO4 を添加した場合と添加しない場合の 2 つの異なる条件下で、水および RPMI CCM への Ag NP の溶解を調査しました。 CuSO4 を添加した場合と添加しない場合の Ag NP の溶解には有意な差があることがわかりました (図 9)。 MQ 水では、CuSO4 添加後の nAg と Ag2O の溶解度の差は、それぞれ 4 倍と 2 倍以上でした。 RPMI CCM では、CuSO4 添加後の nAg 溶解の差は 16 倍以上でした (図 9)。水中での nAg と CuSO4 の混合では、次の式 (1) により Ag NP の溶解を改善する効果があると仮定します。 3:

銀ナノ粒子の溶解。 37 °C のシェーカーで 24 時間インキュベートした後の、CuSO4 (400 mg/L) を添加した場合と添加しない場合の、水および RPMI CCM における銀成分 (100 mg/L) の溶解率。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001。 cAg、コーティングされた銀ナノ粒子。 nAg、ナノ銀; Ag2O、酸化銀。 AgNO3、硝酸銀; CuSO4、硫酸銅; RPMI CCM、ロズウェルパーク記念研究所細胞培養培地。

式 (3) は、銅成分と銀成分の間の酸化還元反応を示しています。

RPMI では、反応は有機化合物の影響を受ける可能性が最も高くなります。たとえば、血清含有 RPMI CCM における AgNO3 の溶解率は 100% である可能性がありますが、遊離 Ag+ イオンのほとんどは血清タンパク質によって複合体を形成します 35。 Cu イオンは Ag イオンが血清タンパク質に結合するのを妨げるため、CuSO4 を含む場合と含まない場合では、RPMI CCM 中の AgNO3 溶液中の遊離 Ag イオンの濃度に大きな差がありました。これらの効果は両方とも、RPMI CCM 中の nAg と CuSO4 の懸濁液中に存在し、CuSO4 を含まないサンプルと比較して、CuSO4 を含むサンプル中の遊離 Ag イオンの量が 16 倍増加します (図 9)。また、前述のように、すでに酸化されたAg2OはRPMI CCM中でCuSO4との抗菌相乗効果を持たず、CuSO4の添加後にこの溶媒中でAg2Oのより良好な溶解は観察されませんでした（図9）。

前のセクション (式 3) で述べたように、Cu+ は Ag NP と Cu2+ イオンの混合物中で生成されます。混合物中に Cu+ が存在することを証明するために、「方法」セクションで説明したように定性的な化学反応を実行しました。成分の混合物では、定性反応により Cu+ の存在が証明されましたが、nAg 懸濁液、AgNO3、または CuSO4 溶液では個別に存在しませんでした。この調査により、予想どおり均衡が確立されたことが実証されました。また、Cu+ はフェントン様反応に類似した反応でスーパーオキシドの存在下で OH ラジカルを生成する能力があるため、Cu+ は Cu2+ と比較してより高い抗菌効果を有することが以前に示されています 36,37。したがって、溶液中での追加の Cu+ イオンの形成は、Ag NP/Cu2+ システムの抗菌相乗効果に影響を与える主な要因の 1 つである可能性があります。

一般に、相乗効果は、コンポーネントの作用メカニズムが異なる場合に発生します。 Ag 成分と Cu 成分 (主に金属であり、NP ではない) 間の抗菌相乗効果は以前に記載されていますが、相乗効果のメカニズムは研究されていません。以前の出版物では、抗菌相乗効果のいくつかのメカニズムが示唆されていましたが、著者らは主に、Ag が細菌の原形質膜を標的とし、Cu が核酸やその他の内部生体分子および細胞構造を変性すると仮説を立てていました 15、16、19、22。対照的に、私たちの研究では、Cu成分とAgNO3（図2）またはポリミキシンBの間に顕著な相乗効果は観察されませんでしたが、両方とも顕著な膜損傷を引き起こしました（図5）。

また、CuO 合金から放出される Cu イオンは、DNA 損傷と脂質過酸化を引き起こす ROS 生成を促進することにより細菌を不活性化することが提案されています 16、19、22。さらに、CuO および Cu(OH)2 に固定された Ag NP は CuO39 と比較して大量の ROS を生成しましたが、この場合、Cu(OH)2 により ROS 生成が増強される可能性があります。しかしながら、生物的条件または非生物的条件におけるCuSO4溶液中での有意なROS生成は観察されなかったが、一方、cAgによるROS生成は著しく高かった。逆に、CuSO4 を添加すると、生物条件および非生物条件における cAg 懸濁液中の ROS 生成量が減少しました (図 6)。

チャンとアル。 (2020) は、Cu2+ イオンの濃度が高い溶液中では、NP からの Ag+ イオンの放出が大幅に高かったことを示しました 23。また、Ag+ の放出量が多いほど、NP インキュベーションの温度が高く、時間が長いことと関連していました 21。この相乗効果のメカニズムは、私たちの研究結果と一致しています。

私たちの研究では、相乗的な抗菌効果には非酸化Ag NPとCuイオンの組み合わせが不可欠であることが示されました。私たちの研究によれば、Ag NP と Cu 成分間の抗菌相乗効果には少なくとも 3 つの理由があります。まず、Cu イオンは酸化還元反応における非酸化 Ag2O の酸化を促進し (式 3)、その結果、Cu2+ の存在下で溶媒中の Ag NP からの Ag+ の溶解が促進されます (図 9)。実際、NP 中の非酸化 AgO は、Ag+ と Cu+ を生成するための Cu2+ との酸化還元反応に必要です。 Ag NP の溶解性が向上すると、溶媒および細菌の細胞内の Ag+ 濃度が高くなり (図 7)、より強力な抗菌効果が引き起こされます。 2 番目の理由は、同じ酸化還元反応での Cu+ イオンの生成です (式 3)。 Cu+ イオンは Cu2+38 と比較して抗菌性が高くなります。 3番目の理由は、Cu2+の存在下では遊離Agイオンが培地中のタンパク質に結合する効果が低下し、その結果、溶液中の遊離Ag+の濃度が高くなるということです（図9）。したがって、相乗作用には、CuO NP からの Cu2+ イオンの放出が必要です。記載されているプロセスはすべて細胞外と細胞内の両方で発生する可能性がありますが、後者は細胞の恒常性にとってより有害です。さらに、ゼータ電位や NP 表面官能基化などの他の要因も抗菌相乗効果に若干の影響を与える可能性がありますが、それを証明するにはさらなる研究が必要です。

AgとCuは古くから抗菌剤として使い分けられてきました。私たちの研究では、Ag と Cu 成分を含む NP 混合物の抗菌効果が、個々の成分の抗菌効果の合計よりも最大 6 倍高いことが示されました。相乗効果のメカニズムは次のとおりです。Cu イオンの存在下では酸化還元反応での酸化により Ag がよりよく溶解すること、同じ酸化還元反応中により抗菌性の Cu+ イオンが生成されること、および Cu イオンの存在下では中間タンパク質への Ag イオンの結合があまり好ましくないことです。 Cuイオンの。 Ag と Cu の抗菌相乗効果は、感染症の排除が必要であり、Ag または Cu 単独の抗菌効果では十分ではない一部の医療問題に対して理想的な解決策となる可能性があります。たとえば、研究の結果は、感染した創傷を治療するための抗菌性創傷被覆材に使用される複合ナノテクノロジーの開発に使用できます。一部の細菌性創傷感染症の治療は未解決の問題であるため、Cu NP と Ag NP に基づいた創傷の併用治療は、創傷感染症の合併症（感染関連の壊疽や切断など）を軽減し、創傷の質調整生存年（QALY）を延長する可能性があります。患者。

すべての化学物質は少なくとも分析グレードのものでした。ポリミキシン B と NaCl は Sigma-Aldrich Co. (米国) から購入しました。 AgNO3 は JT Baker (米国) から、CuSO4 は Alfa Aesar Gmbh & Co. (ドイツ) から入手します。 Life Technologies (米国) の 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート。 Biognost (クロアチア) のリン酸緩衝生理食塩水。 LabM (英国) のトリプトン、酵母エキス、寒天。 Corning (米国) のグルタミンとピルビン酸ナトリウムを含む RPMI 1640。 Gibco (米国) のウシ胎児血清。

3 種類の官能化および非官能化 CuO NP を PlasmaChem GmbH (ドイツ) から入手しました。 CuO NP は、Cu2CO3(OH)2 の分解、続いてメルカプトプロピオン酸による処理による表面基の導入によって PlasmaChem によって合成されました。コーティングされた Ag NP (cAg) は Laboratorios Argenol SL (スペイン) から入手し、コーティングされていない Ag NP (nAg) は Sigma-Aldrich (米国) から入手しました。 Ag2O NP (Ag2O) は、以下に説明するように当社によって合成されました。

市販の NP は乾燥粉末として提供され、懸濁液は、エンドトキシンを含まない Milli-Q® 水 (MQ) で 2000 mg 化合物/l の濃度で試験前に毎回新たに調製されました。 10 ミリリットルの CuO NP 懸濁液をボルテックスし、プローブ超音波処理 (Branson 450 Sonifier、USA) を使用して、比エネルギー 3.9・105 kJ/m340 に相当する音響出力 13 W で 5 分間超音波処理しました。

Ag2O を除くすべての NP の形態と一次サイズは、我々の以前の研究で特徴付けられました 8、13、41。

X 線結晶構造解析と透過型電子顕微鏡による Ag2O NP の特性評価は、タルトゥ大学で実施されました。走査透過型電子顕微鏡 (STEM) 測定は、Cs 補正された FEI Titan Themis 200 装置を使用して行われました。サンプルはイソプロピルアルコール中で調製され、超音波処理され、カーボンフィルムで覆われた TEM グリッド上に堆積されました。溶媒を蒸発させた後、サンプルを明視野 (BF) 検出器と高角度環状暗視野 (HAADF) 検出器で同時に測定しました。

NP の流体力学的サイズ (Dh)、多分散指数 (PDI)、およびゼータ電位 (ゼータ電位) は、MQ 水中の 100 mg/l 懸濁液、または 10% FBS および 1 Malvern Zetasizer (Zetasizer Nano-ZS、Malvern Instruments、英国) を使用した % ピルビン酸ナトリウム (RPMI CCM)。

試験した化合物の金属含有量は、原子吸光分光法 (AAS) (contrAA 800、Analytik Jena Ag) を使用して測定しました。材料とナノ粒子を、1 mL の濃 HNO3 (硝酸微量金属グレード 67 ～ 69%、Seastar Chemicals) 中で 65 ℃で 24 時間インキュベートしました。インキュベーション後、懸濁液をボルテックスし、1% HNO3 で 1:1000 に希釈しました。組織と血清を H2O2 (Perdrogen 30%、Sigma-Aldrich) と濃縮 HNO3 中で次の比率 1:1:8 (組織: H2O2:HNO3) でインキュベートし、65 ℃で 24 時間インキュベートしました。懸濁液を 1% HNO3 で 10 倍に希釈し、AAS で分析しました。測定は、少なくとも 2 つの独立した実験で 3 回行われました。

分析試薬グレード (無水、純度 99.9% 以上) 硝酸銀 (5 mmol、0.85 g) を 50 mL の脱イオン水に溶解し、室温で 1 分間超音波処理して均一な溶液を達成しました。

硝酸銀が完全に溶解した後、水酸化ナトリウム（１０ｍｍｏｌ、０．３９ｇ）を周囲条件で反応混合物に素早く加え、２時間超音波処理した。

最終溶液を冷却した。次いで、得られた黒っぽい沈殿物をワットマン濾紙（グレード５）で濾過し、５０ｍＬのＭＱ水で２回急冷した。次いで、黒色の残留物を７０℃で１２時間乾燥させ、６０％を超える収率を得た。

大腸菌 MG1655 K-12 (大腸菌 K-12) (イェール大学の大腸菌遺伝子ストックセンターから入手)、大腸菌 ESBL (西タリン中央の慢性前立腺炎の 72 歳男性患者の尿から分離)病院)、緑膿菌 PAO1 (フランス、ブザンクの Patrick Plesiat 教授から入手)、Streptococcus dysgalactiae DSM 23,147 (ドイツ、ブラウンシュヴァイクのライプニッツ研究所の微生物および細胞培養のドイツコレクションから入手)、組換え生物発光大腸菌 MC1061 (pSLcueR) /pDNPcopAlux、以前に Ivask らによって私たちの研究室で構築されました 34)、Enterococcus faecalis ATCC 29,212 (西タリン中央病院から入手)、および黄色ブドウ球菌 ATCC 25,923 (西タリン中央病院から入手) は、寒天化ルリア上に保存されました。 – ベルターニ培地 (LB、1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% NaCl、1.5% 寒天)、およびテスト前に 3 mL の RPMI で 37 °C で 200 rpm で振盪しながら一晩培養しました。一晩培養した後、400 μl の接種材料を 20 mL の RPMI CCM と混合し、4 時間インキュベートし、対数増殖期まで増殖させました。インキュベーション後、細菌懸濁液の620 nmにおける光学密度(OD620)を測定し、所望のOD620の懸濁液を調製した。組換え細菌の場合、生物発光をコードするプラスミドを保持するために、RPMI CCM に 100 μg/l アンピシリンと 10 μg/l テトラサイクリンを追加しました。

MBC は、Suppi et al.42 によって記載されたスポットテストを使用して、初期細菌集団の 99.9% を死滅させる最低濃度によって決定されました。一晩培養し、対数増殖期まで 4 時間インキュベートした後、前述のように、MQ、RPMI CCM、または LB 中の OD620 0.07 (2 × 108 細胞/mL43 に相当) の細菌懸濁液が得られました。 100μLの細菌懸濁液を、100μLの成分単独または培地中のそれらの混合物に添加した。細菌を、96 ウェルマイクロプレート (BD Falcon) 上の RPMI CCM、LB、または MQ 中で、暗所で振盪せずに 30 °C で 24 時間曝露しました。インキュベートした懸濁液 3 μl をピペットで寒天化 LB 培地に移し、24 時間のインキュベーション後に細菌細胞の生存率 (コロニーの形成) を視覚的に評価しました。各実験は少なくとも 3 回繰り返されました。

「最小殺菌濃度（MBC）の評価」の項に記載されているように、細菌を試験用に調製した。 MQ、RPMI CCM、または LB 中の OD620 0.03 の細菌懸濁液を、シェーカー内で 37 °C で 3 時間インキュベートし、OD620 での細菌密度を測定しました。

AgNO3、cAg、CuO、CuO-COOH、CuO-NH2、CuSO4、およびポリミキシン B (PB、ポジティブコントロール) による大腸菌および緑膿菌の細胞壁透過性を、N-フェニルナフタレン-1-の細胞取り込みによってアッセイしました。アミン (1-NPN) は、基本的に Helander と Mattila-Sandholm によって記載されているとおりです 44。親水性環境とは異なり、1-NPN の蛍光は疎水性環境 (膜脂質二重層など) では大幅に増強され、グラム陰性菌の外膜 (OM) の完全性を調べるのに適切な色素となります。簡単に説明すると、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (TRIS) 塩基で pH 7.2 に調整した 50 mM 3-(N-モルホリノ) プロパンスルホン酸 (MOPS) 中の 40 μM 1-NPN 50 μL および試験化合物 50 μL (MOPS-TRIS)緩衝液）を黒いマイクロプレートのウェルにピペットで移した。 OD = 0.5の50 mM MOPS-TRIS緩衝液中の細菌懸濁液100 μLを各ウェルに分注し、RTで30分間インキュベートした後、蛍光を測定しました（Fluoroskan Ascent FLプレート照度計、励起/発光フィルター350/460 nm）。 1-NPN 細胞取り込み係数を計算し、試験化合物を添加してインキュベートした細菌懸濁液と試験化合物を添加せずにインキュベートした細菌懸濁液の蛍光値の強度の比として示しました。少なくとも 3 つの独立した実験が技術的に重複して実行されました。

細胞内 Ag および Cu イオンによる細菌における発光の誘導は、組換えバイオセンサー細菌 Escherichia coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) を使用して実行されました。細胞内 Ag および Cu イオンに対する組換え大腸菌の応答は、CueR アクティベータータンパク質と、生物発光をコードする遺伝子に融合されたその制御された copA プロモーターを介して媒介されます 34。したがって、亜毒性領域では、細胞内 Ag および Cu イオンの存在により、用量依存的にこれらの組換え細菌の生物発光が増加します。

試験細菌の調製およびバイオセンサーアッセイの手順は、1 つの例外を除いて細菌増殖阻害アッセイと同様でした。生物発光 Ag バイオセンサー大腸菌 MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) の増殖培地には 100 μg/l アンピシリンが補充され、組換えプラスミドを維持するために、一晩培養中に 10 μg/l テトラサイクリン。生物発光（BL）測定には、Orion II プレート照度計（Berthold Detection Systems）を使用しました。 OD620 0.1 の細菌懸濁液 100 μl を、RPMI CCM (サンプル) または RPMI CCM (バックグラウンド) 中の成分またはその混合物に 30 °C で 4 時間曝露しました。 Ag および Cu バイオセンサーの用量反応曲線は、それぞれのサンプルにおける Ag/Cu バイオセンサーの生物発光 (誘導倍数として) に対して Cu および Ag の適用濃度をプロットすることによって得られました。各成分の生物発光値が最も高い濃度が LC のピークとしてマークされています。フォールド誘導は次のように計算されました。

ここで、BLsample はサンプル中の Ag/Cu バイオセンサーの生物発光であり、BLbackground は NP による発光の暗さを考慮したバックグラウンド生物発光です。

細胞の存在は ROS の生成と中和に影響を与える可能性があるため、ROS を生物条件 (細胞存在下) と非生物条件 (細胞なし) の両方で定量しました。

細胞（生物）ROS 産生を研究するために、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート (H2DCFDA) の新鮮なストックをエタノールに溶解して 0.6 mg/mL の濃度にし、その後 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液で希釈しました。 MQ 水中の成分 100 μL をピペットでウェルに加えました。次に、MQ 水中の細菌培養物 (OD620 = 0.1 の大腸菌 K-12) 100 μL を添加しました。テストプレートを 30 °C で 4 時間インキュベートしました。インキュベーション後、混合物 100 μL を黒色の不透明 96 ウェルプレートに分注し、H2DCFDA を最終濃度 1.5 μg/mL で細胞に添加しました。 30分間のインキュベーション後、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定しました(485/527 nmでの励起/発光)。このアッセイでは、H2DCFDA は細胞膜を通って拡散し、細胞内エステラーゼによって非蛍光性のジクロロフルオレシン (DCFH) に処理されます。 DCFH は、細胞内 ROS の存在により、蛍光性の高い 2',7'-ジクロロフルオレセイン (DCF) に変換されます。

非生物的条件における ROS を研究するために、H2DCFDA の酢酸基を 0.01 M NaOH により室温で 30 分間切断しました。色素を 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液で 24 μg/mL の濃度に希釈し、黒色の不透明 96 ウェルプレートの各ウェルに添加して、最終色素濃度 12 μg/mL を得ました。結果はブランクで除算され、相対光単位 (RFU) として表示されました。

溶解分析では、100 mg/l cAg、Ag2O、nAg、AgNO3、CuSO4 (回収対照) を MQ 水または RPMI CCM 中で 37 °C で 24 時間インキュベートし、その後 320,000 × g で 30 分間遠心分離しました (ベックマン・コールター超遠心分離機）。遠心分離後、上清を収集し、AAS (contrAA 800、Analytik Jena Ag) によって銀濃度を分析しました。 NP溶解率は、遠心分離後の上清中の銀濃度に従って計算し、100mg/lを100%とした。測定は、少なくとも 2 つの独立した実験で 3 回行われました。

Cu+ の検出は、ヨウ素滴定法 45 を使用して実行されました。 Cu2+ はシュウ酸カリウムとの錯体形成によってマスクされました。次に、反応が完了すると現れるヨウ素の存在の指標として 1% デンプン溶液を使用し、2 M 塩酸の存在下でヨウ素酸カリウムにより Cu+ を Cu2+ に酸化しました。

スチューデントの t 検定を使用した P 値、標準偏差および平均値は Microsoft Excel で計算されました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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原稿の英語修正については、Villem Aruoja 博士 (エストニア国立化学物理生物物理研究所) に感謝します。

欧州委員会 (Grigory Vasiliev、Anna-Liisa Kubo、Olesja Bondarenko) からの EIC Accelerator Grant No. 190199469 (NANOWOUND)。エストニア研究評議会からの GOVSG16 助成金 (Grigory Vasiliev、Anna-Liisa Kubo、Olesja Bondarenko)。 Arengufond_OB 国立化学物理学生物物理学研究所の開発基金からの助成金 (Grigory Vasiliev、Anna-Liisa Kubo、Olesja Bondarenko)。エストニア研究評議会からの PRG749 助成金 (Anne Kahru)。エストニア研究機関 (Denys Bondar、Yevgen Karpichev) から COVSG5 を付与。この研究は、欧州地域開発基金プロジェクト「量子およびナノマテリアルにおける新たな秩序」(TK134) によって部分的に支援されました。

環境毒性学研究室、国立化学物理学および生物物理研究所、Akadeemia tee 23、12618、タリン、エストニア

グリゴリー・ヴァシリエフ、アンナ・リーサ・クボ、ヘイキ・ヴィジャ、アン・カル、オレシャ・ボンダレンコ

Nanordica Medical OÜ、Vana-Lõuna tn 39a-7、10134、タリン、ハルジュマー、エストニア

グリゴリー・ワシリエフ、アンナ・リーサ・クボ、オレシャ・ボンダレンコ

タリン工科大学化学・生物工学部、Akadeemia tee 15、12618、タリン、エストニア

グリゴリー・ワシリエフ、デニス・ボンダール、エフゲン・カルピチェフ

エストニア科学アカデミー、Kohtu 6、10130、タリン、エストニア

マザー・カル

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概念化、GV、OB。データキュレーション、GV、A.-LK。形式分析、GV。調査、GV、A.-LK、OB。方法論、GV、A.-LK、OB、HV、DB。プロジェクト管理、OB、AK、YK。リソース、AK、YK、OB。検証、OB。ビジュアライゼーション、GV。ドラフト、GV、OB の作成。原稿のレビュー、GV、A.-LK、OB、HV、DB、YK、AK すべての著者が原稿の出版版を読み、同意しました。

オレシャ・ボンダレンコへの通信。

A.-LK、GV、OB は、ナノ粒子ベースの抗菌製品を開発している Nanordica Medical の共同創設者です。 AK、DB、HV、および YK は、競合する利害関係がないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Vasiliev, G.、Kubo, AL.、Vija, H. 他。銅と銀のナノ粒子の相乗的な抗菌効果とその作用メカニズム。 Sci Rep 13、9202 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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受信日: 2023 年 1 月 27 日

受理日: 2023 年 6 月 4 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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